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本制品为新一代重组克隆试剂盒，一次反应可完成单个至多个DNA片段的重组。其中经优化的Mix预混了重组酶和反应缓冲液，并添加了辅助因子，可显著提高克隆的重组效率和对杂质的耐受度，最快仅需5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高达95%以上。

• 载体线性化处理
  选择合适的克隆位点，对环形载体进行线性化处理。以下两种方法任选其一即可。
  
  • 酶切处理
    建议使用双酶切，可减少载体自连，降低假阳性克隆概率。若使用单酶切，建议适当延长酶切反应时间。酶切处理后，建议进行电泳验证，并对线性化载体切胶纯化。
    
  • 反向PCR扩增
    以预线性化质粒为模板，推荐选择MCE高保真聚合酶（例如2×高保真PCR预混液）进行扩增。
• 目的基因扩增
  
  • 目的基因引物设计原则
    无缝克隆反应要求目的基因与相邻片段具有15～20bp的末端同源性，所以目的基因上下游引物的5'端均需包含一段与已知线性化载体末端同源的碱基序列，引物总长度最好不要超过40bp，Tm值一般在55～65℃，GC含量一般在40～60%。
    
    • 上游引物（Primer F）：
      5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选择）+目的基因特异性正向序列—3'
      
    • 下游引物（Primer R）：
      3'—目的基因特异性反向序列+酶切位点（可选择）+下游载体末端同源序列—5'
    • 目的基因特异性正\反向序列即常规插入片段正\反向扩增引物序列。
      
    • 上游\下游载体末端同源序列为线性化载体最末端序列（用于同源重组）。
    
    
  • 目的基因PCR扩增
    推荐选择高保真聚合酶（例如2×高保真PCR预混液）进行扩增。扩增结束后，建议对PCR产物进行纯化后再用于后续无缝克隆反应。
• 无缝克隆
  
  • 在冰上配制如下反应体系：
    

    成分	实验组	阴性对照	阳性对照
    Seamless Assembly Mix Plus	5μL	5μL	5μL
    线性化载体	50～200ng	50～100ng	/
    目的基因	10～200ng	/	/
    pUC19 Control Plasmid,Linearized	/	/	1μL
    500bp Control Fragment	/	/	1μL
    ddH2O	至10μL	至10μL	至10μL

    • 本反应体系最适载体用量为0.03pmol。
      
    • 当插入单个目的基因时，目的基因与载体的最适摩尔比为2:1。
      
    • 当插入多个目的基因时，每个目的基因与载体的最适摩尔比为1:1。

    摩尔比=	载体浓度(ng/μL)×载体体积(μL)×目的基因大小(bp)
    	目的基因浓度(ng/μL)×目的基因体积(μL)×载体大小(bp)

    • 若目的基因长度大于载体长度时，应互换载体与目的基因的用量，即将目的基因当做载体，将载体当做目的基因再进行计算。
      
    • 线性化载体的使用量在50～200ng之间，目的基因的使用量在10～200ng之间。若按照上述公式计算得到的使用量超出这个范围，建议直接选用最低/最高使用量。
      
    • 若目的基因小于200bp时，建议目的基因与载体的摩尔比为5:1。
      
    • 若使用未经纯化的线性化载体或目的基因时，加样体积不应超过总反应体积的20%。
      
    • 载体或目的基因片段过长均会导致重组效率降低。
  • 用移液枪轻轻吹打混匀（切勿振荡），短暂离心后置于50℃反应5～60min。
    
    • 推荐使用PCR仪等温控较精准的仪器，反应时间过长或过短均会降低克隆效率。
      
    • 当插入1～2个片段时，推荐反应5～15min；当插入3～5个片段时，推荐反应15～30min。
      
    • 若载体大于10kb或目的基因大于4kb时，建议延长反应至30～60min。
  • 将反应液短暂离心后置于冰上冷却，用于后续转化。
    
    • 重组产物可于-20℃暂存一周，待需要时解冻转化即可。
• 转化
  
  • 在冰上解冻100μL感受态细胞。禁止直接用手化冻，会影响感受态细胞的活性。
    
  • 在解冻后的感受态细胞中，加入10μL重组产物，轻轻混匀，在冰上放置30min。
    
  • 将上述反应液于42℃水浴热激45-60 s，迅速放到冰上冷却5min。
    
  • 加入500μL LB或者SOC液体培养基（不含抗生素），37℃，180rpm培养1h。
    
  • 将菌液离心浓缩后涂布在含相应抗生素的固体平板上，37℃倒置培养过夜。
    
    • 不同感受态细胞的阳性克隆率有所区别，推荐使用转化效率较高的感受态细胞。
      
    • 阳性对照平板通常出现大量菌落，而阴性对照几乎没有菌落。
• 阳性克隆子的筛选与鉴定
  过夜培养后，理论上重组平板会出现数百个单菌落，挑取单菌落进行验证。以下两种方法任选其一即可。
  
  • 为确保实验准确性，建议将以下两种方法筛选出的阳性克隆子测序。
  • 酶切验证：挑取单菌落接种至含抗生素的液体培养基中培养，提取质粒后进行酶切验证。
    
  • 菌落PCR：挑取单菌落至10μL ddH2O，95℃裂解10min。取1μL裂解液作为模板，直接进行菌落PCR。菌落PCR扩增时至少使用一条通用引物，以免造成假阳性。